基因測序作為醫(yī)療健康行業(yè)的火爆技術(shù)，近年來越來越得到臨床的認(rèn)可，并逐步被應(yīng)用到各大領(lǐng)域中。尤其是精準(zhǔn)醫(yī)療概念提出以后，基因測序更是備受青睞，它為精準(zhǔn)醫(yī)療解答了很多未知的問題。

　　如今，基因測序已經(jīng)形成了一定的產(chǎn)業(yè)規(guī)模，大量的企業(yè)以不同形式躋身進(jìn)來。但是，在表面飛速發(fā)展的背后，技術(shù)上仍有大量的挑戰(zhàn)。外媒《GEN》Shawn C. Baker博士撰文講解該領(lǐng)域面臨的困難與挑戰(zhàn)。編譯如下：

　　過去十年里，高通量測序技術(shù)經(jīng)歷了跨越式的發(fā)展，測序能力大幅上升，費(fèi)用下降，兩者的變化都是數(shù)量級的。到目前為止，全球范圍內(nèi)，共配備測序設(shè)備超過一萬臺。

　　過去十幾年來，主要的平臺公司都致力于提升系統(tǒng)的易用性。Illumina的最新桌面系統(tǒng)，比如 NextSeq、MiSeq、和MiniSeq 系統(tǒng)，均通過試劑盒進(jìn)行操作，以減少了手工操作的次數(shù)和開機(jī)時間。

　　一直以來， Illumina的系統(tǒng)都比賽默飛的 Ion Torrent 系統(tǒng)更加易用，但后者最新的系統(tǒng)Ion S5特別設(shè)計(jì)簡化了整個工作流程，涉及設(shè)計(jì)準(zhǔn)備庫到數(shù)據(jù)生成的整個流程。

　　行業(yè)外讀者在聽聞了測序行業(yè)的許多進(jìn)展后，如強(qiáng)大的測序能力、更低的成本以及更好的易用性，可能會誤認(rèn)為，基因測序所有的困難已經(jīng)都解決了，測序過程的所有障礙都移除了。

　　但是真正的困難還剛開始，大量的挑戰(zhàn)在前方。

　　樣品質(zhì)量

　　問題最嚴(yán)重的一個領(lǐng)域，也是易被忽略的是：樣品質(zhì)量，雖然測試平臺經(jīng)常會校準(zhǔn)，使用的樣本也是經(jīng)過校準(zhǔn)的，但是真實(shí)世界中的樣本經(jīng)常會面臨很多意想不到的挑戰(zhàn)。

　　在人類基因測序中，一個最普遍使用的樣本類型是FFPE (formalin-fixed paraffin-embedded)。FFPE的廣泛應(yīng)用有多種原因，其中最重要的是豐富性。據(jù)估計(jì)，全球范圍內(nèi)，有超過100億FFPE樣本存檔。FFPE塊的臨床樣本存儲已經(jīng)變成工業(yè)級別的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐，其樣本數(shù)量將繼續(xù)保持增長。

　　除全球范圍的廣泛應(yīng)用外，F(xiàn)FPE樣本通常包含著大量可用的表型信息。例如，F(xiàn)FPE樣本可與治療方法和臨床數(shù)據(jù)綜合應(yīng)用。

　　但FFPE 樣本出現(xiàn)的問題是：固定過程和存儲條件均會造成大量的DNA損傷。

　　BioCule公司CEO、聯(lián)合創(chuàng)始人 Hans G. Thormar博士認(rèn)為，

　　“評估了BioCule的QC平臺超過1000份樣本后，我們看到了DNA樣品中大量的變異和各種類型的損傷，例如鏈間、鏈內(nèi)交聯(lián)，單鏈DNA的聚合以及單鏈DNA破壞?！?

　　“DNA損傷的變異數(shù)量和類型，如果忽略，可能會對最終結(jié)果產(chǎn)生負(fù)面影響?！?

　　Thormar認(rèn)為，這對下游應(yīng)用比如測序的影響是巨大的：從簡單測序文庫構(gòu)建的失敗到虛假文庫的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致結(jié)果的錯誤。因此，在測序項(xiàng)目開始時正確評估每個樣本的質(zhì)量變得至關(guān)重要。

　　測序文庫

　　盡管，各大測序平臺公司花大力氣在降低生成原始序列的成本上，但是在構(gòu)建測序庫方面卻不然。人類基因測序的測序文庫的構(gòu)建，每個樣本大約花費(fèi)50美元，在總花銷中是相對較小的一部分。但是在其他應(yīng)用中，例如細(xì)菌基因組測序或低深度RNA測序，它占據(jù)總成本很大一部分。

　　幾個小組研究了多元化自制解決方案，期望可以有效降低成本，但在商業(yè)領(lǐng)域并沒有太多發(fā)展。在開發(fā)單細(xì)胞測序解決方案中有一個亮點(diǎn)，例如10X Genomics公司的Chromium(TM)系統(tǒng)，利用基于珠的系統(tǒng)可以并行處理數(shù)百到數(shù)萬個樣品。

　　10X Genomics 公司的CEO兼聯(lián)合創(chuàng)始人Serge Saxonov博士堅(jiān)持道，

　　我們認(rèn)為單細(xì)胞RNA測序是進(jìn)行基因表達(dá)分析的正確方式，在接下來的幾年，全球許多地區(qū)，RNA試驗(yàn)將轉(zhuǎn)向單細(xì)胞分辨率，我們的平臺有可能在這方面引領(lǐng)浪潮。

　　對于大型項(xiàng)目，比如在降低樣品成本方面，單細(xì)胞RNA測序中要求的高度多元解決方案將是關(guān)鍵的因素。

　　長讀數(shù)與短讀數(shù)

　　Illumina對于基因測序市場的主導(dǎo)，意味著到目前為止產(chǎn)生的絕大多數(shù)數(shù)據(jù)都基于短讀數(shù)(short reads，高通量測序平臺產(chǎn)生的序列就稱為reads，這是測序讀到的堿基序列片段，測序的最小單位)。大量短讀數(shù)的產(chǎn)生對大多數(shù)的應(yīng)用都很適用。例如檢測基因組DNA的單核苷酸多態(tài)性和計(jì)數(shù)RNA的轉(zhuǎn)錄物。然而，在許多其他的應(yīng)用中，僅有短讀數(shù)是不夠的，例如閱讀基因組的高度重復(fù)區(qū)域和確定長鏈結(jié)構(gòu)。

　　長讀數(shù)平臺，例如Pacific Biosciences公司的RSII和Sequel，Oxford Nanopore的MinION，通常能生成15-20kb范圍長度的讀數(shù)，最高曾報(bào)道過超過100kb長度的讀數(shù)。這樣的平臺贏得科學(xué)界的贊賞，例如加利福尼亞大學(xué)戴維斯分校細(xì)胞生物學(xué)教授Charles Gasser博士。

　　Gasser博士評論道，“我對于用長讀數(shù)方法進(jìn)行基因組裝配的成功印象深刻，特別是與短讀數(shù)高保真數(shù)據(jù)相結(jié)合時的混合裝配中。技術(shù)的結(jié)合使得小群體、小預(yù)算的單個研究者從一個新的生物基因組中產(chǎn)生一個可用的組裝?！?

　　為了充分利用這些長讀數(shù)平臺，有必要通過新方法進(jìn)行制備DNA樣品，標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法尚未優(yōu)化用來分離超長鏈DNA片段，所以，在制備長讀數(shù)庫時必須特別小心。

　　例如，供應(yīng)商創(chuàng)建了一種高分子量試劑盒用于分離大于100kb的的DNA片段，優(yōu)化靶向DNA方案來選擇性富集DNA的大片段，為了保證長讀數(shù)產(chǎn)量的最大化，這些方法和技術(shù)必須掌握。

　　短讀數(shù)的一種特殊形式是鏈接讀數(shù)，例如10X Genomics，可作為真正長讀數(shù)的一種替代方法。鏈接讀數(shù)是這樣產(chǎn)生的：每個長DNA片段，通常大于100kb，其中產(chǎn)生的每個短讀數(shù)，均加入一個獨(dú)一無二的條形碼，在分析階段，這種獨(dú)特的條形碼就可以將分離的短讀數(shù)鏈接在一起，從而提供長鏈基因信息，使得構(gòu)建大單倍型塊和對復(fù)雜結(jié)構(gòu)信息的闡釋成為可能。

　　Saxonov博士建議道，短讀數(shù)測序，因其高精確度和高通量，通常具有強(qiáng)大的功能，但只能獲取小部分的基因信息。這是因?yàn)榛蚪M是基本重復(fù)的，基因組中的大量信息編碼在長鏈中。

　　數(shù)據(jù)分析

　　研究人員面臨的領(lǐng)一大挑戰(zhàn)是生成的數(shù)據(jù)量非常大。單個30X人全基因組樣品的BAM文件(半壓縮比對文件)約為90GB；一個相對中等的項(xiàng)目，包含100個樣本，其BAM文件可達(dá)到9TB。

　　一個Illumina HiSeq X儀器，每年能產(chǎn)生超過130TB的數(shù)據(jù)，很快數(shù)據(jù)的存儲就變成一個大問題。例如，Broad研究所以每12分鐘分析一個30X人全基因組速率產(chǎn)生基因測序數(shù)據(jù)——每年可產(chǎn)生將近4000TB的BAM文件。

　　BAM文件可以轉(zhuǎn)化為VCF文件(變體調(diào)用格式)，后者僅包含不同于標(biāo)準(zhǔn)序列的信息。雖然VCF文件小并且更加好用，但是保存原始序列文件仍是必要的，方便研究者將來查看這些數(shù)據(jù)。

　　隨著測序成本下降，一些人就得出這樣的結(jié)論：對樣本重測序會很容易，并且可能更便宜，而分析大量數(shù)據(jù)時，研究人員的選擇空間非常大。但事實(shí)上，在OMICtools中有超過3000個序列分析工具可供選擇，研究人員想要找到最好的那一個，也不容易。

　　臨床解釋和報(bào)銷

　　最后，對于臨床樣本，還有一個挑戰(zhàn)：對于測序序列的變異提供一致可靠的解釋。

　　一個典型的外顯子包含1萬——2萬個突變，全基因樣本則會產(chǎn)生超過300萬種變異。在通常的解釋中，根據(jù)變異造成的疾病相似性分類。

　　為了協(xié)助指導(dǎo)臨床醫(yī)生，美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)，分子病理學(xué)協(xié)會和美國病理學(xué)家學(xué)院創(chuàng)建了一套對突變進(jìn)行分類的系統(tǒng)。分類目錄包括致病性，可能致病性，不確定的顯著性(目前占外源和全基因組樣本的絕大多數(shù))，可能良性和良性。

　　然而，這種方案有其局限性。即時使用一種公認(rèn)的分類方案分類同一個數(shù)據(jù)庫，不同的項(xiàng)目組可能會提出不同的解釋。對新系統(tǒng)的一個試驗(yàn)研究中，參與的不同臨床實(shí)驗(yàn)室僅在34%的情況下，對于分類的解釋一致。

　　如果存在分歧或需要額外的分析來解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果，那么就存在報(bào)銷的問題?；贜GS的測試的報(bào)銷可能是一個大障礙，但是對于解釋的報(bào)銷幾乎是不可能的。

　　Rady兒童基因組醫(yī)學(xué)研究所臨床研究員Jennifer Friedman博士說，

　　實(shí)驗(yàn)室不可能對試驗(yàn)的解釋付費(fèi)，如果這種服務(wù)可以提供，這是非常有價值的，但是沒有人做到這個。

　　沒有辦法為此付費(fèi)，保險(xiǎn)公司不報(bào)銷。盡管對于精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的關(guān)注度上升，但是無論是臨床醫(yī)生或?qū)嶒?yàn)室做出的解釋，都沒有被醫(yī)療保健支付者承認(rèn)或是重視。

　　到目前為止，病人樣本的分析基本上是作為一個研究項(xiàng)目來對待的，是在研究型醫(yī)院中的一個選擇，并且僅用于有限數(shù)量的患者。

　　未來展望

　　了解道，盡管過去幾年有很大的進(jìn)步，但是整個NGS工作流程，從樣品文庫構(gòu)建到數(shù)據(jù)分析，仍然存在大量的挑戰(zhàn)。隨著基礎(chǔ)技術(shù)的進(jìn)步，新的挑戰(zhàn)將繼續(xù)出現(xiàn)，對于這些基因組技術(shù)的廣泛應(yīng)用和最大化改善人類健康而言，解決這些挑戰(zhàn)是至關(guān)重要的。